2/7/96
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Le dépistage du dopage à la testostérone basé sur la détermination du rapport testostérone/épitestostérone (isomère de la testostérone) pose de nombreux problèmes aux laboratoires accrédités par la commission médicale du Comité International Olympique (CIO). Pour ce rapport T/E une valeur moyenne statistique de 1 a été déterminée ; lors d'un dopage, ce rapport augmente. Le CIO admet qu'un rapport T/E supérieur à 6 est la preuve d'un dopage par la testostérone, or il a été décrit des cas naturels, sans dopage, de rapports T/E compris entre 6 et 9. Depuis 1992, le CIO recommande de pratiquer des contrôles supplémentaires pour les athlètes ayant un rapport T/E compris entre 6 et 10 avant de les déclarer positifs. D'autre part, des valeurs de T/E inférieures à 6 mais voisines de 6 peuvent correspondre à un dopage dans sa phase terminale, c'est-à-dire à un retour vers la normale.
Le Service central d'analyse du CNRS à Vernaison a développé une méthode basée sur la spectrométrie de masse isotopique du carbone (détermination du rapport 13C/12C), permettant de déterminer l'origine de la testostérone urinaire : naturelle (endogène) ou pharmaceutique (exogène). Cette différence dans l'abondance isotopique du carbone vient du fait que la testostérone naturelle humaine est biosynthétisée par l'organisme, le précurseur étant le cholestérol, alors que la testostérone pharmaceutique est obtenue par hémisynthèse à partir de stéroïdes végétaux. La mesure isotopique ne se limite pas à la testostérone mais s'applique aussi à d'autres stéroïdes intervenant dans la chaîne métabolique comme précurseurs (cholestérol, déhydroépiandrostérone, androstènediol) ou comme métabolites (androstanediols). La spectrométrie de masse isotopique est une technique très utilisée dans la recherche de l'authenticité, notamment dans le domaine agro-alimentaire pour déterminer l'origine d'arômes : naturels ou synthétiques...
La première étape de cette méthode consiste en l'extraction des stéroïdes urinaires (extrac-tion en phase solide sur C18, hydrolyse enzymatique, extraction en phase liquide par l'éther et extraction en phase solide sur gel de silice) et en leur purification. Cette purification a été abordée suivant 3 approches différentes : chromatographie liquide en phase inverse C18, acétylation puis chromatographie liquide sur phase inverse C18 ou chromatographie d'immunoaffinité.
La seconde étape est l'analyse isotopique du carbone réalisée par GC/C/IRMS (Gas Chromatography/Combustion/Isotope Ratio Mass Spectrometry) des stéroïdes acétylés. Il s'agit du couplage en ligne de la chromatographie en phase gazeuse (séparation de molécules à étudier), de la combustion (transformation de la molécule en CO2) et ensuite de l'ionisation et de la séparation à l'aide d'un spectromètre magnétique des ions correspondant aux différents isotopomères du CO2. Après détection, le traitement des signaux correspondants permet d'obtenir avec une grande précision les valeurs des rapports 13C/12C. La notation standard du rapport 13C/12C est exprimée en d pour mille par rapport à une référence internationale.
Une cinquantaine d'échantillons urinaires provenant de sujets mâles, n'ayant pas reçu ou ayant reçu de la testostérone (voie orale ou intramusculaire) ont été ainsi traités et analysés. Les volumes d'urines nécessaires : 10 à 50 ml suivant la concentration en testostérone, sont compatibles avec ceux prélevés lors de contrôle antidopage. Il a été ainsi possible de différencier les urines des sujets non traités. L'apport exogène de testostérone (voie orale ou intramusculaire) est mis en évidence par une modification du rapport isotopique du carbone de la testostérone et de ses métabolites (androstanediols). En revanche, ce rapport isotopique n'est pas modifié pour les précurseurs de la biosynthèse de la testostérone (cholestérol, déhydroépiandrostérone, androstènediol).
La nature de l'alimentation a une influence capitale sur la valeur du rapport 13C/12C des stéroïdes, néanmoins cette influence ne devrait pas fausser les résultats : l'analyse isotopique se faisant à différents niveaux de la biosynthèse des stéroïdes, toute variation importante de ce rapport isotopique signifierait un apport exogène de testostérone. Les stéroïdes précurseurs (cholestérol, déhydroépiandrostérone, androstènediol) servent en quelque sorte " d'étalons internes " et leurs valeurs sont propres à chaque individu.
Cette nouvelle technique suscite beaucoup d'intérêts parmi les laboratoires de contrôle anti-dopage et des collaborations sont en cours pour la valider et en définir les limites. Elle pourrait, dans un premier temps, servir de méthode de confirmation pour les cas où l'interprétation du rapport testostérone/épitestostérone pose problème.
Références :
- Aguilera R., Becchi M., Grenot C. [et al.]. Detection of testosterone misuse : comparison of two chromatographic sample preparation methods for gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry analysis. Journal of chromatography B : Biomedical Applications. Accepté pour publication, 1996.
- Aguilera R., Becchi M., Casabianca H. [et al.]. Improved method of detection of testosterone abuse by gas chromatography- combustion-isotope ratio mass spectrometry analysis of urinary steroids. Journal of Mass Spectrometry, 31, 1996, pp. 169-177.
- Becchi M., Aguilera R., Farizon Y. [et al.], Gas chromatography / combustion / isotope-ratio mass spectrometry analysis of urinary steroids to detect misuse of testosterone in sport. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 8, 1994, pp. 304-308.
(D'après CNRS-Info numéro 325 (15/06/96)