n° 383 - avril 2000

Première observation de la densité électronique de valence d'une petite protéine par diffraction des rayons X à ultra haute résolution

Des chercheurs du Laboratoire de cristallographie et modélisation des matériaux minéraux biologiques (LCM3B)* ont procédé à des mesures par diffraction X à très haute résolution sur des cristaux de petits peptides, briques élémentaires des protéines. Ils ont pu ainsi établir pour toutes les fonctions chimiques existant dans les protéines une banque de paramètres décrivant la densité électronique atomique et transférables d'une molécule à une autre. La banque, servant de modèle de départ, leur a permis, pour la première fois, de calculer et de représenter, à partir du spectre de diffraction X ultra haute résolution d'une protéine, sa densité électronique et ses propriétés électrostatiques.

La base de données consiste en un ensemble de paramètres décrivant la charge et la densité électronique à symétrie non sphérique de chaque atome d'un acide aminé. Ces paramètres sont estimés à partir d'expériences de diffraction X haute résolution. La figure 1 donne un exemple de densité électronique, dite de déformation, d'un groupe Carbone=Oxygène d'une fonction peptidique montrant l'arrangement des électrons dû aux liaisons covalentes ainsi que les paires libres d'électrons visibles à proximité du noyau de l'atome d'oxygène.

Figure 1 : Un exemple de densité électronique d'un groupe Carbone=Oxygène. Extrait de la base de données.	Figure 2 : Structure cristallographique de la crambine (46 résidus amino-acides).	Figure 3 : Carte de densité électronique, modèle de déformation dans un plan peptidique CONH de la crambine.

Le développement des synchrotrons et de la cryo-crystallographie permet de réaliser des mesures de diffraction à résolution subatomique sur des protéines. Ainsi, il a été possible d'obtenir des données ultra haute résolution (0,5 Å) sur une protéine, la crambine (800 atomes, 46 résidus amino-acides) (figure 2) ; le spectre a été mesuré au synchrotron de Hambourg par V. Lamzin et M. M. Teeter**. Grâce à l'utilisation de la base de données décrite ci-dessus, l'extension aux protéines des méthodes de détermination de la densité de charges (méthodes jusqu'alors valables uniquement sur de petites molécules) est possible : l'équipe nancéenne a décrit pour la première avec une bonne précision la densité électronique et les charges atomiques de cette protéine.

La figure 3 donne la carte de densité électronique de déformation, dans le plan peptidique CONH, définie comme la différence entre la densité observée et modélisée à partir de l'expérience rayons X synchrotron d'une part et la densité calculée dans une hypothèse d'atomes sphériques, considérés comme libres et sans interaction avec leurs voisins d'autre part ; cette carte fait clairement apparaître sur les liaisons covalentes des résidus de densité électronique dont la paramétrisation analytique permet l'obtention de paramètres électrostatiques, charges atomiques, moments, directement utilisables dans les champs de force de la modélisation moléculaire. En outre, ces résultats expérimentaux ouvrent la possibilité de calibrer les calculs de structures électroniques par des méthodes quantiques.

Les travaux récents en collaboration avec A. Podjarny*** utilisant le synchrotron d'Argonne (APS, USA) montrent la possibilité d'étendre ces travaux à des protéines de taille moyenne et dont la connaissance précise du mécanisme d'action est fondamentale en pharmacologie : ainsi 550 000 intensités diffractées à une résolution de 0,6 Angström ont pu être obtenues à une excellente précision pour des cristaux d'aldose réductase, protéine de 5700 atomes. L'inhibition de cette protéine d'intérêt pharmacologique permet de limiter certaines complications du diabète telles que la cataracte ou les neuropathies. L'analyse fine de son mécanisme catalytique et de la reconnaissance protéine/médicament demande une connaissance approfondie de l'état de charge des atomes du site actif et de leur potentiel électrostatique ce qui est possible dorénavant grâce à ces travaux.

En conclusion, l'utilisation conjointe des synchrotrons de troisième génération (mesure) et de calculateurs parallèles (Centre Charles Hermite, Nancy) rend désormais possible ce type d'investigation grâce à une approche expérimentale, la cristallographie à ultra haute résolution. On peut donc envisager dans un avenir très proche, une compréhension au niveau sub-atomique de processus biologiques complexes tels que les transferts d'électrons et de protons, les réactions d'oxydo-réduction faisant intervenir des centres métalliques réactionnels, l'activation du dioxygéne (hémoglobine). Les réactions chimiques catalysées par certaines métalloprotéines (réduction de l'hydrogène ou de l'azote) représentent un enjeu environnemental de la plus haute importance.

Références :

• C. Jelsch, M. Teeter, V. Lamzin , V. Pichon-Pesme, R. H. Blessing and C. Lecomt. Accurate protein crystallography at ultra high resolution : valence Electron distribution in crambin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. (2000) 97, pp. 3171-3176.
  
• V. S. Lamzin, R. S. Morris, Z. Dauter, K. S. Wilson and M. Teeter (1999), J. Biol. Chem. 274, pp. 20753-20755.

* CNRS-Université Henri Poincaré (Nancy 1).

** Respectivement au Laboratoire européen de biologie moléculaire, Heidelberg (Allemagne) et à l'Université de Boston (USA).

*** Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire, Strasbourg.

La diffraction des rayons X par les cristaux est un outil privilégié de détermination de la structure tridimensionnelle des molécules. En effet, les rayons X interagissent avec le nuage électronique des atomes du cristal. Le cristal étant un milieu périodique tridimensionnel, ces ondes diffusées interfèrent et provoquent le phénomène de diffraction. La mesure de ces intensités diffractées donne alors accès aux composantes de Fourier de la densité électronique de la molécule. Une détermination structurale consiste donc à repérer, après un certain nombre d'étapes de calculs, les maxima de densité électronique, que l'on assimile aux positions atomiques. Le développement, durant ces vingt dernières années, de sources intenses de rayons X (synchrotrons) et de la puissance de calcul des ordinateurs a permis la détermination de nombreuses structures de protéines à résolution quasi-atomique (1-3 Å).
Par ailleurs, des méthodes plus sophistiquées de détermination de la densité électronique précise ont été développées pour les petites molécules et les matériaux minéraux, en particulier à Nancy : la distribution des électrons autour des atomes dans une molécule s'organise notamment pour former les liaisons covalentes. À un niveau plus fin, le nuage électronique se déforme aussi sous l'influence de la géométrie de la molécule et des interactions non-liées interatomiques et intermoléculaires. Les méthodes cristallographiques d'analyse de la densité de charge décrivent à la précision de 0,05 électron/Å3 la distribution des électrons dans un solide ou une molécule cristallisée ; la densité électronique réelle est alors modélisée analytiquement, à partir des spectres de diffraction X, conduisant à une estimation expérimentale précise des charges atomiques, du potentiel et du champ électrostatiques. Bien entendu, ces méthodes ne s'appliquaient avant ce travail uniquement qu'à des systèmes mesurés à une résolution subatomique (< 0,7 Å), et aux petites mailles cristallines donc aux petites molécules ou matériaux à structure simple.