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En direct des laboratoires de l'institut de Chimie

 

Une autre façon d’appréhender le mécanisme des hydrogénases

Les études du fonctionnement des enzymes, longtemps basées sur des méthodes cinétiques, ont été dominées pendant toute la fin du XXème siècle par des techniques spectroscopiques ou structurales basées sur l'interaction matière-rayonnement : il fallait voir pour croire. Dans le même temps, le développement de méthodes numériques récompensé en 2013 par le prix Nobel de chimie allait permettre d'étudier "in silico" des systèmes chimiques de très grande taille. Dans un article publié dans Nature Chemistry, des chercheurs du Laboratoire de bioénergétique et ingénierie des protéines (CNRS / Ais-Marseille Université) viennent de montrer qu'il est possible de combiner les approches cinétiques et théoriques pour mieux comprendre le mécanisme d’oxydation de l’hydrogène par des métalloenzymes. Ce travail est le fruit d'une collaboration avec des chimistes théoriciens italiens et anglais, et des biochimistes de l'INSA à Toulouse et du CEA à Saclay.

 

A Marseille, l'Unité de bioénergétique et ingénierie des protéines a pour champ thématique la caractérisation des chaînes respiratoires bactériennes et développe une approche pluridisciplinaire pour l'étude des relations structure-fonction dans les métalloenzymes, ainsi que leur utilisation dans le contexte des bioénergies et de l'environnement. Les hydrogénases, enzymes qui catalysent la production de dihydrogène ou son oxydation (H2=2H++2e-), sont l'un des systèmes les plus étudiés au laboratoire.

Dans les hydrogénases de type “FeFe”, le dihydrogène est oxydé grâce à un site actif [Fe2CN2CO3dtma] (dtma=dithiométhylamine) représenté sur la figure A. Le dihydrogène se fixe sur le Fer “distal”, marqué d'une étoile, qui est aussi la cible de l’oxydant O2<. L'oxydation du H2 produit des protons, acceptés séquentiellement par l'azote du dtma, et des électrons qui peuvent être transférés vers une électrode, ce qui permet de mesurer la vitesse de turnover et ses variations en fonction des conditions expérimentales.

Lorsque le potentiel de l'électrode est changé comme indiqué sur la figure B, les variations de courant montrent que l'enzyme s'inactive à haut potentiel (figure C) pour des raisons qui viennent seulement d'être comprises. L'hypothèse présentée dans la littérature, basée sur des études de petites molécules modèles du site actif, proposait que l'inactivation résulte de la coordination du fer distal par l'azote du dtma, fer qui ne pouvait alors plus coordiner H2. Cette hypothèse a été récemment exclue par des calculs prenant en compte la matrice protéique autour du site actif.

Les expériences d'électrochimie qui viennent d’être menées par l’équipe marseillaise montrent que le processus d'inactivation est biphasique et que sa vitesse est proportionnelle à la concentration en H2 (figure D), ce qui démontre que l'inactivation résulte de la fixation non-productive du dihydrogène pour former deux états inactifs distincts, impliquant l’existence d’autres formes du site actif capables de fixer H2. Les calculs de dynamique moléculaire suggèrent que le site actif est suffisamment flexible pour autoriser le changement de position des ligands CO intrinsèques au site actif, en accord avec l'effet de la mutation de la phénylalanine conservée (panel A). Ce mouvement rend vaquant des sites de coordination normalement occupés par les ligands CO intrinsèques, sur lesquels les calculs DFT suggèrent que le dihydrogène peut se fixer (cercles turquoises sur les figures E à G). Les calculs qui prédisent que le fer a une sphère de coordination complète dans les états inactifs sont en accord avec les observations expérimentales qui montrent que les atomes de fer sont protégés du dioxygène.

C'est donc une combinaison d'informations issues de techniques variées (mutagenèse dirigée, calculs DFT, cinétique électrochimique etc…) qui a permis d'élucider le mécanisme d'inactivation de l'hydrogénase et de montrer que la flexibilité du site actif autorise une chimie de coordination plus riche qu'on ne pouvait l'imaginer.

fourmond

Panel A : site actif de l'hydrogénasse à FeFe. Panels B et C: expérience de chronoampérométrie dans lesquels on impose en une série de pas de potentiel à l'électrode (B) et où l'on mesure le courant (donc l'activité enzymatique) qui en résulte (C). Panel D: constante de vitesse de formation des espèces inactives en fonction de la concentration en dihydrogène. Panels E,F et G: différents mode de coordination de H2 sur le site actif de l'hydrogénase à FeFe, pour la forme active (E) et les formes inactives (F et G).

© Vincent Fourmond

 

 

Référence

Vincent Fourmond, Claudio Greco, Kateryna Sybirna, Carole Baffert, Po-Hung Wang, Pierre Ezanno, Marco Montefiori, Maurizio Bruschi, Isabelle Meynial-Salles, Philippe Soucaille, Jochen Blumberger, Herve Bottin, Luca De Gioia et Christophe Leger

The oxidative inactivation of FeFe hydrogenase reveals the flexibility of the H-cluster

Nature Chemistry 16 mars 2014, 4, 336-341
doi:10.1038/nchem.1892

 

Contact chercheur 

Vincent Fourmond, Laboratoire de bioénergétique et ingénierie des protéines – Marseille

Courriel : vincent.fourmond@imm.cnrs.fr

Tél. : 04 91 16 45 36

Web: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06/

Twitter: @BIP6_Marseille

 

Contacts institut

Christophe Cartier dit Moulin, Jonathan Rangapanaiken

 

27 mars 2014

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