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En direct des laboratoires de l'institut de Chimie

 

Aquamarine: une protéine fluorescente cyan optimisée avec seulement deux mutations

 

Les protéines fluorescentes cyan (CFPs) dérivées de la Green Fluorescent Protein(GFP) sont intégrées dans de nombreux senseurs intracellulaires très utilisés en recherche fondamentale et pré-clinique, ainsi que dans le secteur des biotechnologies. Une très forte amélioration a été obtenue dans les performances de diverses CFPs utilisées actuellement, après l'introduction de seulement une à deux mutations. Ces résultats ouvrent la voie à l'amélioration rapide des biosenseurs existants, et apportent des informations précieuses sur les bases structurales de la fluorescence des GFPs.

 

Les GFPs permettent la construction de biosenseurs optiques codés génétiquement, réunissant dans moins de 100 Å les trois fonctions essentielles d'un nanocapteur, que sont l'adressage, la détection chimique spécifique et la conversion optique. Elles disposent en outre d'un potentiel d'évolution quasi-illimité via la mutagenèse naturelle ou articifielle. Une très large part de ces biosenseurs utilise le phénomène de FRET (Förster resonant energy transfer) entre deux protéines fluorescentes spectralement accordées pour former une paire donneur/accepteur. Malgré l’immense variété des protéines fluorescentes déjà disponibles, les couples réellement utilisables pour la construction de biosenseurs FRET restent peu nombreux. Les protéines à émission bleue-verte (cyan) en association avec une protéine à fluorescence jaune de la même famille forment la paire donneur-accepteur la plus souvent utilisée, principalement en raison de la robustesse de leur processus de maturation in vivo.

Comparée à la GFP, la CFP présente des performances optiques médiocres, avec un rendement quantique de fluorescence de seulement 36% pour la Enhanced cyan fluorescent protein(ECFP), et de 67% pour la Cerulean (une forme améliorée obtenue en 2004). Plus grave encore, la ECFP comme la Cerulean souffrent d'une mauvaise photostabilité, et leur fluorescence est très sensible à de nombreux paramètres physico-chimiques tels que pH et température. De plus, leur déclin d'émission de fluorescence complexe, fortement multiexponentiel, a limité jusqu'à présent leurs applications en imagerie de durée de vie (FLIM-FRET). Les efforts pour améliorer la CFP par des techniques d'évolution dirigée ont abouti ces deux dernières années à l'obtention de rendements quantiques proche de l'unité (jusqu'à 93% pour la mTurquoise2 parue en 2012), avec des déclin d'émissions pratiquement monoexponentiels. Ces variants figurent à présent parmi les GFPs les plus fluorescentes connues. Néanmoins, en raison des méthodes de mutagenèse aléatoire utilisées, ces nouvelles CFPs sont porteuses de nombreuses mutations dont le rôle reste incompris, et leur introduction dans les biosenseurs actuels nécessite des étapes complexes de biologie moléculaire.

En partant de la ECFP, et en introduisant par étapes un petit nombre de mutations précises, les chercheurs du Laboratoire de Chimie Physique (CNRS / Université Paris-Sud) ont montré que seulement deux mutations (H148G et T65S) suffisent à conférer à la ECFP des performances très proches de la mTurquoise2 (rendement quantique de 89%, déclin d'émission monoexponentiel). Le variant obtenu, Aquamarine (Mol. BioSyst., 2012), s'avère de plus très photostable et exceptionnellement insensible au pH et à de nombreux autres paramètres environnementaux. Les chercheurs ont également montré que la mutation unique T65S dans la Cerulean permet d'atteindre des performances équivalentes (PLoS ONE, 2012). Ainsi, la très grande majorité des biosenseurs existants va pouvoir être rapidement et fortement améliorée. Ces travaux font l'objet d'un dépôt de brevet par le CNRS (FR1155227 CNRS-UPS 2011). En collaboration avec une équipe du laboratoire Neurobiologie des Processus Adaptatifs (CNRS / Université Pierre et Marie Curie) et dans le cadre d'une thèse financée par C'Nano Ile-de-France, cette nouvelle Aquamarine a déjà été utilisée avec succès dans des biosenseurs d'activité kinase de type AKAR.

Cette découverte révèle aussi les mécanismes moléculaires déterminant les performances optiques des GFPs en général, qui sont étudiés par les chimistes théoriciens du LCP. La mutation T65S restaure l'acide aminé naturellement présent dans la forme sauvage AvGFP, et correspond à la suppression d'un simple groupement méthyle. Cet acide aminé semble jouer un rôle crucial dans l'organisation des liaisons hydrogènes qui assurent la rigidité du chromophore, dont les torsions à l'état excité peuvent être responsables de fortes pertes du rendement de fluorescence et de la photostabilité.

 

Références

Asma Fredj, Hélène Pasquier, Isabelle Demachy, Gabriella Jonasson, Bernard Levy, Valérie Derrien,Yasmina Bousmah, Gallia Manoussaris, Frank Wien, Jacqueline Ridard, Marie Erard, Fabienne Merola
The Single T65S Mutation Generates Brighter Cyan Fluorescent Proteins with Increased Photostability and pH Insensitivity

PLOS ONE Novembre 2012, 7(11), e49149.

DOI:10.1371/journal.pone.0049149

 

Marie Erard, Asma Fredj, Hélène Pasquier, Dahdjim-Benoît Beltolngar, Yasmina Bousmah, Valérie Derrien, Pierre Vincent, Fabienne Merola
Minimum set of mutations needed to optimize cyan fluorescent proteins for live cell imaging

Mol. BioSyst. Novembre 2012

DOI:10.1039/C2MB25303H

 

Contacts 

Fabienne Merola, Laboratoire de Chimie-Physique - Orsay
Courriel : fabienne.merola@u-psud.fr
Tél : 0169153017

 

Communication LCP : Eve Ranvier
Courriel : eve.ranvier@u-psud.fr
Tél. : 01 69 15 66 93


Contacts institut

Christophe Cartier dit Moulin, Jonathan Rangapanaiken

 

12 décembre 2012

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