Excitation biphotonique simultanée de cellules exprimant la Channelrhodopsin-2.

Pour comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux, les biologistes stimulent sélectivement le ou les neurones de leur choix. A côté des méthodes traditionnelles invasives reposant par exemple sur l’utilisation d’électrodes, les scientifiques ont mis récemment au point une approche non invasive combinant optique et génétique : un faisceau laser stimule le neurone en excitant directement des canaux ioniques inclus dans la membrane de la cellule. Une collaboration de physiciens et de biologistes européens et américains vient de mettre au point une amélioration de cette approche permettant de cibler spécifiquement par excitation bi-photonique un seul neurone ou un petit groupe de neurones. Ce travail a été publié dans la revue Nature Methods.

La première étape du travail consiste à rendre les neurones sensibles à la lumière par des méthodes génétiques. Il s’agit d’insérer dans la membrane des neurones des molécules telles que la Channelrhodopsin-2, une molécule permettant à des algues vertes de détecter la lumière. Il est alors possible de stimuler sélectivement un neurone en l’éclairant : la lumière provoque l’ouverture du canal ionique formé par la molécule de Channelrhodopsin-2. L’utilisation de l’excitation bi-photonique, qui repose sur l’utilisation de faisceaux laser pulsés dans l’infrarouge, offre l’avantage de pouvoir exciter des cellules neuronales avec une très grande précision en profondeur dans le cerveau. Cependant si la tache lumineuse est très focalisée le nombre de canaux ouverts est insuffisant, tandis que si la tache est trop grande, ce sont plusieurs couches de neurones qui sont excités et l’avantage de la sélectivité de l’excitation bi-photonique est perdu. Une collaboration de physiciens et de biologistes du laboratoire Neurophysiologie et nouvelles microscopies (NNM - CNRS / Univ. Paris Descartes / INSERM) vient de palier ce problème en adaptant la zone de focalisation de la lumière d’excitation à la forme du neurone tout en gardant le sectionnement optique. Avec cette méthode, les chercheurs parviennent à stimuler optiquement les neurones dans des cultures cellulaires et en tranches (Fig.1 c,d). Pour la première fois, plusieurs neurones ou compartiments cellulaires ont ainsi été photoactivés par excitation bi-photonique de manière simultanée.

Activation bi-photonique de la ChR2.

a) Fluorescence bi-photonique d’une tache circulaire et d’un patron d’excitation adapté sur une dendrite avec la méthode décrite. b) Projection y-z de la propagation de la tache circulaire. c) Epi-fluorescence d’un neurone pyramidal de la couche V, exprimant ChR2-YFP et contenant de l’Alexa 594 en tranche. d) Trains de potentiels d’action générés dans le neurone c par excitation bi-photonique (10 ms d’excitation) à différentes fréquences. Echelle : 10 µm