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Comment la structure du canal des hydrogénases influence l'affinité pour l’hydrogène et la sensibilité à l'oxygène

 

Dans les enzymes appelées hydrogénases, qui catalysent l'oxydation biologique de l'hydrogène, le site actif est enfoui au sein de la protéine et connecté au solvant par un canal dont on soupçonnait que la structure détermine partiellement la reconnaissance du substrat et des inhibiteurs. Dans un article publié dans la revue Nature Chemical Biology le 6 décembre 2009, des chercheurs du Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, à Marseille, établissent des relations quantitatives entre la structure de ce canal, les vitesses de transport intramoléculaire du substrat et des inhibiteurs, et la sensibilité de l'enzyme à l'oxygène. Ces résultats permettent d'identifier les déterminants moléculaires de la sensibilité de cette enzyme aux dommages oxydatifs.

 

De nombreuses métalloenzymes produisent, consomment ou sont inhibées par des petites molécules comme l’oxygène (O2), l’hydrogène (H2), le monoxyde de carbone (CO) ou le monoxyde d’azote (NO). Leur diffusion à l'intérieur de la protéine, depuis ou vers le site actif, est guidée par des canaux. C'est le cas des hydrogénases, enzymes qui catalysent l'oxydation du H2, dans lesquelles ces cavités permettent le transport du substrat H2 mais aussi des inhibiteurs CO et O2. L'inactivation des hydrogénases par l'O2 est l'un des obstacles à leur utilisation dans des dispositifs de production d'énergie à partir de H2, et l'un des projets du laboratoire Bioénergétique et Ingénierie des Protéines (UPR9036) vise à modifier par ingénierie génétique ces enzymes pour les rendre fonctionnelles en présence d'oxygène. Ce contexte a donc motivé une étude fondamentale de l'influence de la structure du canal de l'hydrogénase sur les cinétiques de transports intramoléculaires.

Les techniques de spectroscopie résolue en temps, utilisées depuis les années 1950 pour étudier le transport du monoxyde de carbone et du dioxygène dans des petites protéines hémiques comme la myoglobine, ne peuvent pas être appliquée à la caractérisation du transport intramoléculaire dans des enzymes dont le site actif est non-hémique. Les chercheurs ont donc récemment mis au point une méthode électrochimique pour mesurer des vitesses de diffusion le long des canaux de l'hydrogénase. Il s'agit de mettre à profit la très bonne résolution temporelle de la mesure électrochimique de l'activité pour déterminer les vitesses de liaison et de dissociation du monoxyde de carbone, un inhibiteur compétitif de l'enzyme qui arrive au site actif en diffusant le long du même canal que le substrat. (voir la brève).

Grâce à cette technique, les chercheurs ont pu mesurer et comparer les vitesses d'inhibition par le CO et l'O2 d'un grand nombre de formes mutées de l'hydrogénase « Nickel-Fer » de la bactérie Desulfovibrio fructosovorans caractérisées au préalable par spectroscopie à résonance paramagnétique électronique, et deux hydrogénases "Fer-Fer", homologues mais dont la sensibilité à l'oxygène est différente, celles des bactéries Clostridium acetobutylicum et Desulfovibrio desulfuricans. Ils  ont montré que le CO et l'O2 accèdent au site actif à la même vitesse, et que celle-ci peut varier de plusieurs ordres de grandeur sous l'effet de certaines mutations ponctuelles. La taille et la charge des chaînes latérales des acides aminés qui encombrent le canal ont des effets cumulatifs. Les mutations ont le même effet relatif sur les vitesses de diffusion du substrat et des inhibiteurs, mais le H2 diffuse beaucoup plus rapidement que l'O2. Pour cette raison, les mutations qui ralentissent le transport dans le canal n'ont qu'une influence modérée sur l'activité d'oxydation de H2.

De nombreuses hydrogénases de type « Nickel-Fer » et « Fer-Fer » ont été caractérisées ces dernières années et il est frappant de constater à quel point des enzyme dont les sites actifs sont très homologues peuvent avoir des sensibilités à l'oxygène différentes. Cette variabilité de propriétés est expliquée en partie par nos résultats, qui démontrent que des mutations ponctuelles qui modifient la structure de la protéine loin du site actif peuvent avoir des effets spectaculaires sur la sensibilité à l'oxygène.

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Gauche: Extrémité du canal, côté site actif, de l'hydrogénase à Nickel-Fer de la bactérie D.fructosovorans. Le site actif est matérialisé par deux sphères (rouge et verte) à l'arrière plan. Dessphères plus petites indiquent la position de molécules d'eau. Les résidus L122, V74 and E25, quidéterminent la forme de l'étranglement dans le canal, sont indiqués par des bâtons. Droite : exemples de signaux électrochimiques permettant de déterminer commentl'oxygène affecte l'activité des différents mutants.© Liebgott et al.

 

En savoir plus

  • Relating diffusion along the substrate tunnel and oxygen sensitivity in hydrogenaseP.-P. Liebgott, F. Leroux, B. Burlat, S. Dementin, C. Baffert, T. Lautier, V. Fourmond, P. Ceccaldi, C. Cavazza, I. Meynial-Salles, P. Soucaille, J. Fontecilla-Camps, B. Guigliarelli, P. Bertrand, M. Rousset, C. Léger
    Nature Chemical Biology, online 6 december 2009
    http://dx.doi.org/10.1038/nchembio.276

 

Contact chercheur

Christophe Léger
Unité de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines
CNRS UPR 9036
Institut de Microbiologie de la Méditerranée
31 chemin Joseph Aiguier
13402 Marseille Cedex 20

 

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