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Une avancée technologique majeure pour l’étude des protéines des membranes biologiques

Des chercheurs du laboratoire de biologie physico-chimique des protéines membranaires (UMR 7099, IBPC, Paris) viennent de développer une méthodologie innovante d’immobilisation des protéines membranaires sur des surfaces solides. Ces travaux qui ont de nombreuses applications en recherche fondamentale et biomédicale sont publiés le 13 Janvier 2009 dans la revue PNAS.

Les membranes biologiques contiennent de nombreuses protéines membranaires (PMs), qui jouent des rôles très importants dans le fonctionnement et la communication cellulaires. Ces protéines reçoivent, en particulier, la plupart des messages chimiques qui régulent la fonction et la croissance des cellules. Pour cette raison, leur dysfonctionnement est à l'origine de nombreuses pathologies, et elles sont la cible d'environ 70% des médicaments les plus utilisés. Par ailleurs, lors d’une infection, les PMs des organismes pathogènes (parasites, bactéries, virus) sont reconnues par notre système immunitaire qui produit des anticorps détectables dans la circulation sanguine. Etudier l'interaction des PMs avec des molécules chimiques (développement de médicaments), des anticorps (diagnostic) ou d'autres molécules (partenaires biologiques naturels) présente donc un très grand intérêt en recherche aussi bien fondamentale que biomédicale.

L’étude in vitro des PMs implique leur extraction des membranes biologiques et leur maintien sous forme soluble en solution aqueuse. Ces étapes sont habituellement réalisées grâce à des détergents qui recouvrent la surface hydrophobe normalement en contact avec l'intérieur de la membrane et rendent ainsi les PMs hydrosolubles. Les détergents présentent cependant un désavantage, celui de déstabiliser les PMs et donc de rendre difficile l’étude de leur structure et de leur fonction.

L’équipe animée par Jean-Luc Popot dans le laboratoire de biologie physico-chimique des protéines membranaires (UMR 7099, Paris, dir. B. Miroux) travaille, depuis de nombreuses années, à la mise au point de polymères amphiphiles appelés "amphipols" (1,2). Il s'agit de longues molécules filiformes porteuses de groupes chimiques dont certains sont hydrophiles et d'autres hydrophobes. Les amphipols peuvent se substituer aux détergents à la surface transmembranaire des PMs en leur apportant une sorte de "combinaison de plongée" qui les rend hydrosolubles. L'association entre PM et amphipol, bien que non covalente c'est-à-dire dépourvue de liaison chimique forte, est extrêmement stable. Par ailleurs, les PMs ainsi "habillées" sont beaucoup plus stables biochimiquement qu'en solution détergente (leur durée de vie augmente en général considérablement).

Les chercheurs ont synthétisé des amphipols porteurs du groupe biotine (encore appelé vitamine H), qui forme des liaisons très stables avec la protéine avidine. Les amphipols ainsi « biotinylés » s'associent de façon essentiellement irréversible  à une surface couverte d'avidine (puce, bille etc.). S'ils sont eux-mêmes associés à une PM, ils vont, tels une sorte de velcro, entraîner avec eux la PM qui "colle", indirectement mais irréversiblement, à la surface solide. Ce mode d'association est très robuste et extrêmement doux pour la protéine d’intérêt car celle-ci n’interagit pas directement avec le support. Il est de surcroît applicable à toute protéine dotée d'une région transmembranaire. L'amphipol remplit donc une triple fonction : rendre la PM soluble dans l'eau, la stabiliser biochimiquement et l'immobiliser. Lorsque la PM est ainsi immobilisée, il devient possible d'étudier par diverses méthodes (résonance de plasmon de surface, fluorescence...) la façon dont elle interagit avec des molécules hydrosolubles ajoutées à la solution : anticorps, médicaments, toxines, partenaires biologiques naturels (voir le schéma expérimental ci-dessous).

figure article Popot

Figure : 1- Une protéine membranaire reste soluble en solution aqueuse en présence de détergent parce que celui-ci recouvre la surface transmembranaire - très hydrophobe - de la protéine, la protégeant ainsi du contact avec l'eau.
2- Le détergent peut être remplacé, par simple échange en solution, par un polymère amphiphile spécialement conçu ('amphipol'). A la différence du détergent, celui-ci s'associe à la protéine de façon irréversible.
3- Si l'amphipol porte une fonction chimique, telle qu'une biotine, susceptible d'interagir avec une surface solide, il cause l'immobilisation de la protéine, sans que celle-ci interagisse directement avec le support.
4- Il devient alors possible d'examiner les interactions avec la protéine de molécules ajoutées à la solution qui baigne le support. Cette technologie a été validée pour la détection d'anticorps (protéine immobilisée sur puces, détection par résonance de plasmon de surface) et, en collaboration avec le laboratoire de nanobiologie de K.L. Martinez (Université de Copenhague), pour celle d'une toxine fluorescente (immobilisation sur billes).
Image de A. O. Dohn, reproduite de Charvolin et al. (2009).

Cette méthodologie, brevetée par le CNRS, présente un grand potentiel en recherche fondamentale (étude de partenaires naturels des PMs), mais aussi en pharmacologie (criblage de molécules actives) ou pour le diagnostic (recherche d'anticorps circulants dirigés contre des PMs d'organismes pathogènes). Son exploitation pour la recherche fondamentale et appliquée est l'un des objectifs principaux d'un réseau européen en cours de constitution, qui regroupe une quinzaine de laboratoires aussi bien publics que privés.

 

Références
1. Tribet, C., Audebert, R. & Popot, J.-L. (1996). Amphipols: polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15047-15050.
2.  Popot, J.-L., Berry, E. A., Charvolin, D., Creuzenet, C., Ebel, C., Engelman, D. M., Flötenmeyer, M., Giusti, F., Gohon, Y., Hervé, P., Hong, Q., Lakey, J. H., Leonard, K., Shuman, H. A., Timmins, P., Warschawski, D. E., Zito, F., Zoonens, M., Pucci, B. & Tribet, C. (2003). Amphipols: polymeric surfactants for membrane biology research. Cell. Mol. Life Sci. 60, 1559-1574.

 

En savoir plus

  • The use of amphipols as universal molecular adapters to immobilize membrane proteins onto solid supports.
    Charvolin, D., Perez, J.-B., Rouvière, F., Giusti, F., Bazzacco, P., Abdine, A., Rappaport, F., Martinez, K. L. & Popot, J.-L.
    Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2009), 106 : 405-410
    Published online before print December 30, 2008, doi:10.1073/pnas.0807132106

 

Contact chercheur

Laboratoire de biologie physico-chimique des protéines membranaires
UMR7099 (CNRS/Université Paris 7)
Institut de Biologie Physico-Chimique (CNRS FRC 550)
13 Rue Pierre et Marie Curie
75005 Paris

 

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