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Parutions

 

Les trois modes de microscopies enfin corrélées pour analyser un même échantillon

 

Une équipe de l’Institut Pasteur de Lille a réalisé un tour de force technologique en développant une méthodologie originale et innovante qui permet d’observer un échantillon, qu’il soit inorganique ou vivant, avec une résolution inégalée, à l’échelle nanométrique, en microscopie optique de super-résolution, en microscopie à force atomique et en microscopie électronique. Cette étude a été publiée le 21 avril 2017  dans la revue Methods in Cell Biology.

 

La microscopie corrélative permet de combiner des informations ultrastructurales obtenues en microscopie électronique avec l’identification de certains compartiments cellulaires et leur dynamique fonctionnelle en microscopie photonique. Cette méthode est nommée CLEM (correlative light electron microscopy). Il est ainsi possible d’examiner la structure fine d’une vésicule exprimant un marqueur fluorescent spécifique. Comme exemple, on peut citer l’autophagie avec la présence d’un marqueur moléculaire, Atg8/LC3-II, au niveau d’une vacuole avec une (autophagosome) ou deux (LC3-associated phagosome) membranes externes caractérisant ce type de compartiment intracellulaire. L’analyse en fluorescence peut être réalisée avec les techniques dites de super-résolution qui permettent d’avoir une résolution nanométrique ; cette approche définit le super-CLEM. Cette même résolution, voire plus encore, est obtenue en microscopie à force atomique (AFM) qui dérive de la microscopie à effet tunnel (ou STM scanning tunneling microscopy).

 

STM et AFM font partie de la microscopie de champ proche et ont permis l’éclosion d’un nouveau domaine : les nanosciences. En effet, il est ainsi devenu possible de voir et manipuler des atomes. L’AFM permet outre d’imager, de faire des mesures d’adhérence, de forces d’interactions, de viscosité et d’élasticité. Le principe repose sur l’indentation dans l’échantillon d’un très petit levier dont le déplacement est suivi par un faisceau laser réfléchi au dos du levier vers une photodiode 4 quadrant.

 

Dans cette étude, les chercheurs présentent des résultats combinant pour la première fois les trois types de microscopie dans une approche corrélative, c’est-à-dire sur le même échantillon, qu'ils ont baptisée CLAFEM pour Correlative Light Atomic Force Electron Microscopy. Il est donc désormais possible d’ajouter aux analyses en CLEM la possibilité de réaliser des mesures physiques (mécaniques) sur des échantillons comme des cellules vivantes en milieu liquide. Cette prouesse technologique a été réalisée en utilisant un AFM couplé à un microscope permettant d’effectuer des mesures en super-résolution STED (Stimulated Emission Depletion ou déplétion par émission stimulée) avant que l’échantillon ne soit analysé en microscopie électronique à transmission ou à balayage (voir les exemples dans la publication d'une bactérie dans un autophagosome ou de l'analyse du cytosquelette).

 

Ce tour de force technologique, permet d’envisager l’étude, sur le vivant, de structures identifiées en fluorescence et dont les propriétés biophysiques peuvent être quantifiées avec une précision inégalée avant, une fois l’échantillon soumis à un traitement spécifique, d’en apprécier l’ultrastructure. Ceci permet également de pouvoir "sentir" l’intérieur de la cellule, tel un doigt discernant entre parties molles de la main et parties dures (tendons et os), en utilisant la tomographie d’élasticité, une méthode également introduite par cette équipe en collaboration avec l’Ecole Polytechnique de Lausanne1.

 

C’est une nouvelle ère de caractérisation qui s’ouvre avec l'approche CLAFEM. Elle permet de déterminer les propriétés biophysiques de compartiments intracellulaires identifiés dont on peut suivre l’évolution dans des situations physiopathologiques. En particulier, on peut citer l'étude de l’effet de modifications de la composition lipidique ou du cytosquelette qui altérent les propriétés mécaniques des cellules lors de processus infectieux, neurodégénératifs, cancéreux ou lors de désordres métaboliques (diabètes, maladies lysosomiales…).

 

1. Roduit C, et al. Biophys J. 2008 Feb 15;94(4):1521-32.

Figure : Comète d’actine de Shigella flexneri dans des cellules PtK2. En haut, région scannée; en bas, zoom du rectangle en ligne pointillée. (a) Diagramme du système biologique: bactéries en gris ; trois comètes sont présentes en rouge, bleu et vert. (b) Image en champ large DIC. (c) image en super-résolution photonique dSTORM. (d) section en microscopie électronique à transmission (MET). (e) Carte d’élasticité (profondeur d’indentation 30-45 nm). (f) Carte d’élasticité superposée avec l’image dSTORM. (g) Image dSTORM superposée avec l’image MET. Barre d’échelle 1 μm.
© Frank Lafont

 

 

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Contact chercheur

  • Frank Lafont


    Equipe Microbiologie Cellulaire et Physique de l'Infection
    Centre d’infection et d’immunité de Lille
    CNRS UMR 8204 - INSERM U1019 –
    Université Lille 2 –Université des Sciences et techniques de Lille
    Institut Pasteur de Lille
    1, rue du Professeur Calmette
    59019 Lille Cedex

     

    03 20 87 11 36


Mise en ligne le 01 juin 2017
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