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Agents biologiques pathogènes

 

Encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles et les prions : à propos des mesures techniques de prévention

Avis du Comité d'experts sur les Encéphalopathies Subaiguës Spongiformes Transmissibles (ESTs) et les Prions - Version 2 - Octobre 96.

En préambule, le comité souhaite indiquer l'absolue nécessité de pouvoir assurer une recherche dans les conditions optimales de sécurité. Il souhaite aussi émettre des recommandations qui restent en deçà de risques non probabilisables et qui permettent aux laboratoires de travailler.
Le Comité souhaite aussi réaffirmer qu'une incertitude subsiste sur la nature de(s) agent(s) des encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESTs).

Les molécules des organismes inférieurs présentant des propriétés "prions" sont à classer au même niveau que l'organisme dont elles sont issues. Le classement des OGM obtenus à partir des gènes codant pour ces molécules suit les règles établies par la Commission de Génie Génétique.

 

Le risque biologique est pris en compte de manière spécifique dans les textes suivants :

1°) Dans le Code du Travail (décret n° 94-352 du 4 mai 1994).

Selon leur risque infectieux vis à vis de l'homme, les agents sont classés en 4 groupes. Les agents des ESTs sont classés à un niveau de risque 3. Concernant les mesures de confinement, les principales caractéristiques d'un laboratoire de sécurité 3 sont précisées dans l'arrêté du 13 août 1996, paru au J.O. du 7 septembre 1996. Ce texte qui émane du Ministère du Travail, a été validé par l'ensemble des ministères concernés (Recherche, Environnement, Agriculture ...).

2°) Les risques hospitaliers et anatomopathologiques sont pris en compte dans la circulaire DGS/DH n° 100 du 11 décembre 1995.

3°) La directive 90/679 CE du Conseil de l'Europe du 26 novembre 1990 précise les conditions de sécurité dans lesquelles doivent être pratiquées les autopsies.1

4°) Le risque concernant la dissémination de micro- organismes est traité par la loi n° 92-654 du 13 juillet 1992 et les décrets d'application du 27 mars 1993, du 27 décembre 1994 et la circulaire du 16 avril 1996, relatifs à l'utilisation confinée et la dissémination d'organismes génétiquement modifiés. La règle est que la classement ne peut pas être inférieur à celui de l'agent non modifié.

5°) Définition du confinement pour la thérapie génique chez les animaux transgéniques (textes rédigés par la Commission de Génie Génétique modifiant le Guide du Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, édition 1993).

6°) L'AFNOR propose dans sa norme NF X 42 075 (1990) une classification des micro-organismes patdogènes pour les animaux domestiques, qui se calque sur celle adoptée pour les agents pathogènes pour l'homme (Ea1 à Ea3).

 

1 Les prescriptions applicables aux chambres funéraires (décret n° 94-1118 du 20 décembre 1994) sont plus "contraignantes" que celles requises pour l'agrément des salles d'autopsie où sont effectués des prélèvements à des fins scientifiques !

 

L'application de certaines mesures spécifiques prévues est optionnelle et dépend du résultat de l'évaluation des risques.

Certaines mesures de confinement peuvent être adaptées aux caractéristiques des ESTs :

1°) Compte tenu que la contamination aérienne n'a jamais été mise en évidence, la mise en pression négative d'un laboratoire dédié aux ESTs n'est pas obligatoire. Cependant l'existence d'une ventilation mécanique contrôlée avec filtres HEPA est recommandée.

2°) Une attention toute particulière doit être portée au traitement des déchets et des effluents.

Les méthodes de décontamination retenues sont rappelées dans la circulaire DGS/DH n° 100 du 11 décembre 95. Le comité rappelle qu'aucune ne constitue une garantie absolue. Il s'agit de (1) l'autoclave à 138°C pendant 18 minutes, (2) la soude (1N pendant 1 heure à 20°C) et (3) l'hypochlorite de sodium (à 2% de chlore libre pendant 1 heure à 20°C : 250 ml d'eau de Javel à 48°/1,750 l eau). Compte tenu de la résistance des agents des ESTs aux métdodes habituelles de décontamination microbiologique, les déchets solides devront être incinérés.

Un autoclave à double entrée n'est pas obligatoire pour le niveau P3. Cependant, l'autoclavage préalable à l'incinération présente l'avantage de diminuer l'infectiosité des déchets, et est recommandé. Les déchets liquides et les effluents du laboratoire ou de l'animalerie doivent être décontaminés avant d'être rejetés aux égouts.

3°) Avertissement : le tableau ci-dessous constitue avant tout un cadre de réflexion à confronter à la particularité de chaque protocole expérimental et à sa réalisation dans les faits. Le débat qui s'ouvrira au cours des colloques organisés cet automne par la Cellule de Coordination Interorganismes s'efforcera de faire ressortir des positions divergentes. Le Comité, dans son rapport définitif les notifiera, soit en modifiant sa position ou en argumentant sa position.

Le confinement physique du laboratoire vise principalement à une prévention collective du risque et a un caractère général. Les mesures de protection individuelle résident essentiellement dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire. L'arrêté du 7 septembre 96 indique des procédures de laboratoires à respecter. Cependant, pour être plus spécifique et aider les laboratoires à travailler sans susciter des peurs irrationnelles, le Comité propose de mettre en place des groupes de travail qui élaboreront des procédures spécifiques aux principaux actes techniques. L'atelier sur les métdodes de décontamination qui se tiendra en décembre permettra de les harmoniser.

 

Les principales situations à risque peuvent être classées schématiquement en fonction des souches manipulées et de la nature des manipulations.

 

  Souches stabilisées, tremblantes naturelles(5) ESB (1), souches humaines
Prélèvements voir Circulaire DGS 100(2) voir Circulaire DGS 100(2)
Les actes à visée descriptive dans le contexte des infections naturelles (anatomopathologie, western-blott...) 2 3
Construction de banques d'ADN génomique à partir de tissus sains et non génétiquement modifiés 2 2
Construction d'OGM avec des vecteurs d'expression non mobilisables ni transmissibles par aérosols, exprimant la protéine PrP ou une forme tronquée de la protéine(4) 3 3
Construction d'OGM avec des vecteurs d'expression mobilisables ou potentiellement transmissibles par aérosols, exprimant la protéine PrP ou une forme tronquée de la protéine(4) 3(3) 3(3)
Construction d'OGM exprimant un peptide de la protéine PrP (4) 2 2
Etudes de biologie structurale pour lesquelles il s'agit de manipuler une protéine recombinante à forte concentration(4) 3 3
Génétique moléculaire à visée épidémiologique 2 2
Biologie cellulaire sur des cellules autres que de primates 2 3
Biologie cellulaire sur des cellules de primates 3 3
Purification de l'agent à partir de prélèvements, manipulation de l'agent à de fortes concentrations 3 3
Expérimentation animale, typage de souches (5) 2 3

(1) Le classement de la ESB en classe 3 est proposé au titre de l'arrêté du 18 juillet 1994, compte tenu des caractéristiques très particulières de cette souche et des données épidémiologiques humaines

(2) Les déchets solides devront être incinérés. Les effluents liquides décontaminés.

(3) Laboratoires L3 nécessairement en dépression.

(4) Compte tenu de ce que tous les systèmes d'expression peuvent conduire à un changement conformationnel aboutissant à l'expression d'une molécule infectieuse, il convient de réaliser l'expression du gène prp dans des laboratoires de niveau de sécurité 3, que le gène ait été modifié ou non. Il n'y a pas lieu de faire des distinctions suivant l'espèce du gène exprimé. Il convient toutefois de souligner que l'expression du gène prp humain muté doit être entrepris avec beaucoup de prudence.
Ces manipulations requièrent l'accord préalable de la Commission de Génie Génétique, dont les décisions font autorité.

(5) Tremblante du mouton non typée suspecte d'être de l'ESB : niveau de sécurité 3.
Le confinement primaire qui est exigé pour les animaux de laboratoire (souris...) ne peut pas être raisonnablement exigé pour la stabulation des grands animaux (chiens, singes, boeufs...). Le manipulateur devra donc être équipé de faÁon à assurer sa propre protection (scaphandre autonome). Cependant, compte tenu de ce que la contamination aérienne n'a jamais été mise en évidence, la protection pourra être adaptée aux ESSTs.

 

Classes de risque et confinements adoptés par la Commission de Génie Génétique

(basés sur les conclusions du Comité d'experts sur les Encéphalopathies Subaiguës Spongiformes Transmissibles et les Prions, octobre 1996)

La classe de risque des expériences mettant en jeu des souches humaines de la ESB ou des souches de tremblante du mouton non typées, et plus particulièrement des OGM qui en sont dérivés, est la Classe 3. Celle attribuée aux souches stabilisées de la ESB et à la tremblante naturelle du mouton est la Classe 2.

Les principales situations à risque donnent lieu aux prescriptions de confinement données dans le tableau ci-dessous en fonction des souches manipulées et de la nature des manipulations.

 

  Souches stabilisées, tremblantes naturelles (5) ESB (1), souches humaines, tremblante non typée
Prélèvements voir Circulaire DGS 100(2) voir Circulaire DGS 100(2)
Les actes à visée descriptive intéressant les organes présumés infectés, dans le contexte des infections naturelles (anatomopatdologie, western-blott...) L2 L3
Construction de banques d'ADN génomique à partir de tissus sains et non génétiquement modifiés dans le gène prp L2 L2
Construction d'OGM avec des vecteurs d'expression non mobilisables ni transmissibles par aérosols, exprimant la protéine PrP ou une forme tronquée de la protéine(4) L3 L3
Construction d'OGM avec des vecteurs d'expression mobilisables ou potentiellement transmissibles par aérosols, exprimant la protéine PrP ou une forme tronquée de la protéine(4) L3(3) L3(3)
Construction d'OGM exprimant un peptide démontré non infectieux de la protéine PrP (4) L3(5) L3(5)
Etudes de biologie structurale pour lesquelles il s'agit de manipuler une protéine recombinante à forte concentration(4) (6) L3 L3
Génétique moléculaire à visée épidémiologique L2 L2
Biologie cellulaire sur des cellules autres que de primates L2 L3
Biologie cellulaire sur des cellules de primates L3 L3
Purification de l'agent à partir de prélèvements, manipulation de l'agent à de fortes concentrations L3 L3
Expérimentation animale, typage de souches (7) L2 L3


(1) , (2) , (3) et (4) id tableau précédent

(5) Jusqu'à démonstration de la non infectiosité du peptide, puis L2 ou L1 en fonction de la non toxicité du peptide.

(6) Les conditions expérimentales dans les appareillages de biologie structurale seront examinées au cas par cas.

(7) id (5) du tableau précédent et se référer également au document CGG Animaleries grands animaux.

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